本发明是关于由下式(I)代表的化合物:及其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药及溶剂化物。这些化合物可作为增强神经突触生长及预防或治疗与HDAC有关疾病(尤其是肿瘤或细胞增殖疾病)的药剂;它们亦可作为促进神经生长的药剂。特别地,本发明化合物可作为抗神经退化疾病及脊髓肌肉萎缩症的药剂。
1.一种如下式(I)代表的化合物,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="93"/>其中R₁及R₂各自独立为OH、OC(=O)烷基、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-C_3-8环烷基、S-C_3-8环烷基、N-C_3-8环烷基、O-不饱和5-至10-元单环或双环、S-不饱和5-至10-元单环或双环、N-不饱和5-至10-元单环或双环、烷基、烯基、炔基、C_3-8环烷基、不饱和5-至10-元单环或双环、或饱和或不饱和的包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子的5-至10-元杂环;或R₁及R₂一起形成二氧戊环;R₃及R₄各自独立为OH、OC(=O)烷基、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-C_3-8环烷基、S-C_3-8环烷基、N-C_3-8环烷基、O-不饱和5-至10-元单环或双环、S-不饱和5-至10-元单环或双环、N-不饱和5-至10-元单环或双环、烷基、烷烯基(alkylenyl)、炔基、C_3-8环烷基、不饱和的5-至10-元单环或双环、或饱和或不饱和的包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子的5-至10-元杂环;R₅为C_4-16烷基或C_4-16烯基,其中所述烷基或烯基为未经取代或经一或多个C_1-6烷基、OH、卤素、CN、NO、N₃、NH₂、CHO、OR₉、SR₉、NR₉或COOR₉取代;R₆为C_2-12烷基或C_2-12烯基,其中所述烷基或烯基为未经取代或经一或多个C_1-6烷基、OH、卤素、CN、NO、N₃、NH₂、CHO、OR₉、SR₉或NR₉取代;或R₅及R₆中之一为氢、卤素或OH,另一为C_4-16烷基或C_4-16烯基,其中所述C_4-16烷基或C_4-16烯基是未经取代或经一或多个C_1-6烷基、OH、NH₂、卤素、CN、NO或N₃取代;R₇及R₈各自独立为氢、卤素、OH、NH₂、COOH、CHO、CN、NO、C_1-6烷基、=O、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基,其中所述C_1-6烷基未经取代或经OH、NH₂、COOH、卤素、CN、NO或CHO取代;或R₇及R₈一起形成一双键、C_3-6烷基、或5-至10-元杂环,其中所述5-至10-元杂环包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子;R₉为苯基、C(=O)R¹⁰、C(=O)OR¹⁰或苄基;及R¹⁰为OH、NHOH、NH₂、C_1-6烷基、苯基或苄基;限制条件为当R₁、R₂、R₃及R₄为OH时,R₅不为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="55"/>且R₆不为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="30"/>或H;或当R₁、R₂、R₃及R₄为OH且R₅为H时,R₆不为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="56"/>或ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="57"/>及其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药及溶剂化物。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中R₁及R₂各自独立为OH,OC_1-6烷基,OC(=O)C_1-6烷基,O-苯基或O-苄基,或R₁及R₂一起形成二氧戊环。
3.根据权利要求2所述的化合物,其中R₁及R₂各自独立为OH,OCH₃,OCH₂CH₃,OCH₂CH₂CH₃,OC(=O)CH₃,O-苯基或O-苄基。
4.根据权利要求1所述的化合物,其中R₁及R₂一起形成二氧戊环。
5.根据权利要求1所述的化合物,其中R₃及R₄各自独立为OH,OC_1-6烷基,OC(=O)C_1-6烷基,O-苯基或O-苄基。
6.根据权利要求1所述的化合物,其中R₃及R₄各自独立为OH,OCH₃,OCH₂CH₃,OCH₂CH₂CH₃,OC(=O)CH₃,O-苯基或O-苄基。
7.根据权利要求1所述的化合物,其中R₅为:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="143"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="156"/>
8.根据权利要求1所述的化合物,其中R₆为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="33"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="167"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="69"/>
9.根据权利要求1所述的化合物,其选自由下列组成的群组:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="100"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="119"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="90"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="111"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="116"/>及ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="110"/>
10.根据权利要求1所述的化合物,其选自由下列组成的群组:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="145"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="118"/>及ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="113"/>
11.一种如权利要求1所定义的式(I)化合物的立体异构物,其由下式(II)代表:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="74"/>其中R₁,R₂,R₃,R₄,R₅,R₆,R₇及R₈具有它们在式(I)中的定义。
12.一种抑制组织蛋白去乙酰酶的医药组合物,其包含如权利要求1至9项中任一项所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药或溶剂化物作为活性成份,及医药可接受载剂。
13.一种如权利要求1至9项中任一项所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药或溶剂化物在制造用于抑制组织蛋白去乙酰酶的药物方面的用途。
14.一种如权利要求1至9项中任一项所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药或溶剂化物在制造用于治疗肿瘤或细胞增生疾病的药物方面的用途。
15.一种如权利要求1至9项中任一项所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药或溶剂化物在制造用于增进神经突触生长的药物方面的用途。
16.一种如权利要求1至9项中任一项所述的化合物或其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药或溶剂化物在制造用于治疗神经退化性疾病及人类脊髓肌肉萎缩症的药物方面的用途。技术领域
本发明是关于新颖化合物,其作为预防或治疗与组织蛋白去乙酰酶(histonexa0deacetylase,HDAC)有关的疾病(尤其是肿瘤或细胞增殖疾病)的药剂;所述化合物亦可作为促进神经突触生长(neutritexa0ourgrowth)的药剂。特别地,本发明化合物可作为抗神经退化疾病及人类脊髓肌肉萎缩症(SMA)的药剂。
背景技术
真核DNA是高度组织化并装配于细胞核中。该组织化及装配经由形成复合物结构的蛋白质(包括核心组织蛋白H2A、H2B、H3及H4)、染色质及DNA的加入而达成。核心组织蛋白的修饰对染色质的构形改变最为重要。乙酰化的程度与转录活性有关,且乙酰化接着诱导出一个开放染色质构形,其使得转录机组接近激活子。组织蛋白去乙酰酶及组织蛋白乙酰基转移酶(histonexa0acetyltransferase,HAT)为影响转录的酶,藉由将接近核心组织蛋白胺端的离胺酸的ε-胺基选择性地去乙酰化或乙酰化。HDAC为11个酶(同功酶)的家族,由于其涉及基因表达的控制,成为许多疾病(包括癌症)的主调控者。HDAC的破坏与各种人类癌症有关;HDAC酶或同功酶似乎涉及多种不同的癌症。HDAC抑制剂成为治疗固态及血液性恶性肿瘤的新一类抗癌剂。近年来,已鉴定出许多结构上歧异的HDAC抑制剂;在细胞培养及动物模式中,它们抑制肿瘤细胞增生并诱导分化及/或凋亡。HDAC抑制引起乙酰化的核组织蛋白蓄积于肿瘤及正常组织,在活体内,可作为HDAC抑制剂的生物活性的替代标记。HDAC抑制剂对基因表达的效果具有高度选择性,导致特定基因的活化(如周期素依赖性激酶(cyclin-dependentkinase)抑制剂p21WAF1/CIP1),但抑制其它基因。HDAC抑制不仅导致组织蛋白的乙酰化,也导致其它因子的转录,如p53、GATA-1及雌激素受体α。非组织蛋白乙酰化的功能上重要性及HDAC抑制剂诱导肿瘤细胞生长逮捕、分化及/或雕亡的精确机制目前正是大量研究的焦点(Anticancerxa0Drugs.2002xa0Jan;13(1):1-13)。HDxa0AC抑制剂在目前的临床试验上已显示具有活性且代表基于新作用机制的具有功效的一类分子标的抗肿瘤剂。发表于Medicalxa0Researchxa0Reviews,Vol.26,No.4,pp.397-413,2006的评论论文指出,已有四种HDAC抑制剂(短链脂肪酸、烃肟酸(hydroxamicxa0acid)、苯甲酰胺及环肽)被报导。以烃肟酸为主的混杂极性化合物(hyxa0bridxa0polarxa0compound,HPC)为HDAC抑制剂,其在微摩尔浓度或较低浓度时诱导分化(Journalxa0ofxa0thexa0Nationalxa0Cancerxa0Institute,Vol.92,NO.15,Augustxa02,2000,pp.1210-1216)。USxa06,174,905、EPxa00847992、JPxa0258863/96及日本第10138957号申请案揭示了诱导细胞分化及抑制HDAC的苄酰胺衍生物。WOxa001/38332揭示了作为HDAC抑制剂的其它化合物。Humxa0Genet,2006,120,pp.101-110已报导苄酰胺M344在处理Sxa0MA患者的纤维母细胞64小时后,向上调控SMN2蛋白质的表达达到7倍。另已有报导指出,丁酸钠(sodiumxa0butyrate)在转殖基因鼠模型中,可改善脊髓及延髓性肌萎缩的表型表达(Humanxa0Molecularxa0Genetics,2004,Vol.13,No.11,pp.1183-1192)。Trichostatinxa0A是一种HDAC抑制剂,其被发现可诱导MCF-7乳癌细胞中泛素依赖细胞周期素D1(ubiquitin-dependentxa0cyclinxa0D1)的降解(MolecularCancer2006,5:8;该文献可下载自:http://www.molecular-cancer.com/content/5/1/8)。USxa07,169,801揭示了用于抑制HDAC的具有式Z-Q-L-M或Z-L-M的化合物。USxa06,888,027涵盖了一群磺酰胺的HDAC抑制剂,其中包括PXDxa0101。EPxa01301184涵盖了作为HDAC抑制剂以治疗固态肿瘤的丙戊酸(valproicxa0Acid)及其衍生物。然而,仍需要发展新类型的HDAC抑制剂以预防或治疗癌症。
发明内容
本发明的目的是提供一种如下式(I)的化合物:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="119"/>及其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药及溶剂化物。所述化合物可作为增强神经突触生长及预防或治疗与HDAC有关疾病(尤其是肿瘤或细胞增殖疾病)的药剂;它们亦可作为促进神经生长的药剂。特别地,本发明化合物可作为抗神经退化疾病及脊髓肌肉萎缩症的药剂。本发明是关于衍生自蜂胶的新颖化合物,其是作为增强神经突触生长及预防或治疗与HDAC有关疾病(尤其是肿瘤或细胞增殖疾病)的药剂。本发明的化合物可有效地经由分化途径抑制癌症细胞生长。特别地,本发明化合物可作为抗神经退化疾病及人类脊髓肌肉萎缩症的药剂。本发明的化合物据此,本发明关于一种如下式(I)的化合物:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="84"/>其中R₁及R₂各自独立为OH、OC(=O)烷基、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-C_3-8环烷基、S-C_3-8环烷基、N-C_3-8环烷基、O-不饱和5-至10-元单环或双环、S-不饱和5-至10-元单环或双环、N-不饱和5-至10-元单环或双环、烷基、烷烯基(alkylenyl)、炔基、C_3-8环烷基、不饱和5-至10-元单环或双环、或饱和或不饱和的包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子的5-至10-元杂环;或R₁及R₂一起形成二氧戊环;R₃及R₄各自独立为OH、OC(=O)烷基、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-C_3-8环烷基、S-C_3-8环烷基、N-C_3-8环烷基、O-不饱和5-至10-元单环或双环、S-不饱和5-至10-元单环或双环、N-不饱和5-至10-元单环或双环、烷基、烷烯基(alkylenyl)、炔基、C_3-8环烷基、不饱和5-至10-元单环或双环、或饱和或不饱和的包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子的5-至10-元杂环;R₅为C_4-16烷基或C_4-16烯基,其中所述烷基或烯基为未经取代或经一或多个C_1-6烷基、OH、卤素、CN、NO、N₃、NH₂、CHO、OR₉、SR₉、NR₉或COOR₉取代;R₆为C_2-12烷基或C_2-12烯基,其中所述烷基或烯基为未经取代或经一或多个C_1-6烷基、OH、卤素、CN、NO、N₃、NH₂、CHO、OR₉、SR₉或NR₉取代;或R₅及R₆之一为氢、卤素或OH,另一为C_4-16烷基或C_4-16烯基,其中所述C_4-16烷基或C_4-16烯基未经取代或经一或多个C_1-6烷基、OH、NH₂、卤素、CN、NO或N₃取代;R₇及R₈各自独立为氢、卤素、OH、NH₂、COOH、CHO、CN、NO、C_1-6烷基(未经取代或经OH、NH₂、COOH、卤素、CN、NO或CHO取代)、=O、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基;或R₇及R₈一起形成一双键、C_3-6烷基、或5-至10-元杂环,其中所述5-至10-元杂环包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子;R₉为苯基、C(=O)R¹⁰、C(=O)OR¹⁰或苄基;及R¹⁰为OH、NHOH、NH₂、C_1-6烷基、苯基或苄基;限制条件为当R₁、R₂、R₃及R₄为OH时,R₅不为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="54"/>且R₆不为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="30"/>或H;或当R₁、R₂、R₃及R₄为OH且R₅为H时,R₆不为ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="54"/>或ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="57"/>及其医药上可接受的盐、立体异构物、镜像异构物、前药及溶剂化物。本文中,用语“烷基”代表直或分支烃链;烷基较佳为C_1-10烷基;更佳为碳原子数选自1-8的烷基;烷基更佳为C_1-6烷基或C_1-4烷基。烷基的实例包括甲基(-CH₃)、乙基(-CH₂CH₃)、丙基(-CH₂CH₂CH₃)、异丙基((CH₃)₂CH)及丁基(-C₄H₉)。本文中,用语“烯基”代表直或支链的不饱和烃基,其中不饱和仅是指双键。根据本发明,烯基包括一或多个双键。烯基较佳为C_2-16烯基,更佳为烯基的碳原子数选自2-12。烯基的实例包括乙烯基(-CH=CH₂)、丙烯基(-CH=CHCH₃或-CH₂CH=CH₂)、丁烯基(-CH₂CH=CHCH₃或-CH=CHCH₂CH₃或-CH₂CH₂CH=CH₂)、-CH₂CH=C(CH₃)CH₃、-CH₂-CH=CH-CH₂-CH₂-CH=CH-CH₃及-CH₂-CH=C(CH₃)-CH₂-CH₂-CH=C(CH₃)-CH₃。本文中,用语“炔基”代表直或支链的不饱和烃基,其中不饱和仅是代表三键。炔基碳原子数较佳为选自2-8;炔基更佳为C_2-6炔基或C_2-4炔基;炔基的实例包括丙炔基(即-CH₂C≡CH)。本文中,用语“环烷基”代表脂肪族环(饱和碳环)。环烷基碳原子数较佳为选自3-8。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基及环己基。本文中,用语“不饱和5-至10元单环或双环”代表不饱和5-至10元单环或双环(稠合或其它)系统,其实例包括苯基及萘基。本文中,用语“饱和或不饱和的包括至少一选自N、O及S的群组的杂原子的5-至10-元杂环”代表饱和或不饱和的5-至10-元杂环系统,其包括至少一个选自N、O及S的环杂原子,每一基团可视需要经至少一个选自下列群组的取代基取代:硝基、羟基、氧代、卤素、羧基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷羰基,C_1-6烷氧羰基、及苯基。上述杂环的实例包括吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、吡唑、咪唑、噻唑、噁唑、异噁唑、噻二嗪、噁二唑、噻吩、呋喃、喹啉、异喹啉、及它们的类似物。本文中,用语“卤素”代表氟、氯、溴及碘。本文中,用语“医药上可接受盐”包括那些与有机或无机酸或碱所形成的盐。医药上可接受酸加成盐包括那些与矿物酸(如氢氯酸、氢溴酸、硫酸及磷酸)或有机酸(如柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、甲酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、草醋酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、p-甲苯磺酸、苯磺酸及羟乙基磺酸)形成的盐。医药上可接受碱盐包括铵盐、碱金属盐(如钠及钾盐)、碱土金属盐(如钙及镁盐)、及有机碱盐(包括一级、二级及三级胺盐)。本文中,用语“前药”代表一化合物在身体内转变(例如在血液中水解)成其具有医疗效果的活性形式。本文中,用语“溶剂化物”代表包括本发明化合物及溶剂的复合物,它们在其中发生反应或自其中沉淀或结晶。本文中,用语“立体异构物”为异构物分子,其分子连接相同但分子的空间排列不同。本文中,用语“镜像异构物”代表彼此仅具有镜像结构关系但无法令其互相重叠一致的立体异构物,如一个人的左手及右手是“相同”但相反的。根据本发明式(I)化合物的一个具体实施例,较佳地,R₁及R₂各自独立为OH、OC_1-6烷基、OC(=O)C_1-6烷基、O-苯基或O-苄基;或R₁及R₂一起形成二氧戊环。更佳地,R₁及R₂各自独立为OH、OCH₃、OCH₂CH₃、OCH₂CH2CH₃、OC(=O)CH₃、O-苯基或O-苄基。根据本发明式(I)化合物的一个具体实施例,较佳地,R₃及R₄各自独立为OH、OC_1-6烷基、OC(=O)C_1-6烷基、O-苯基或O-苄基。较佳地,R₃及R₄各自独立为OH、OCH₃、OCH₂CH₃、OCH₂CH₂CH₃、OC(=O)CH₃、O-苯基或O-苄基。根据本发明式(I)化合物的一个具体实施例,较佳地,R₅为ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="165"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="166"/>根据本发明式(I)化合物的一个具体实施例,较佳地,R₆为ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="159"/>根据本发明,本发明的较佳的式(I)化合物是选自由下列组成的群组:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="149"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="101"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="135"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="132"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="142"/>本发明还关于根据本发明式(I)化合物的立体异构物,其如下列式(II)所示:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="85"/>其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇及R₈如上式(I)中所定义。根据本发明的一较佳具体实施例,式(I)化合物具有下列式(III)、(IV)、(V)或(VI):ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="165"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="118"/>根据本发明,本发明式(I)化合物可抑制HDAC并因此可用于预防或治疗与HDAC有关的疾病。此外,本发明化合物显著抑制多种癌症细胞株的生长,包括鼠C6神经胶质瘤(C6xa0glioma)、人类胶状母细胞瘤(glioblastoma)、人类乳癌细胞、人类血癌细胞及人类黑色素细胞瘤细胞。抑制癌症细胞生长的机制可经由分化途径,特别是通过经诱导的分化及经调控的细胞周期调节子基因表达(包括那些p21及细胞周期素B1)。此外,本发明式(I)化合物可中介神经干细胞的神经元分化,且因此可作为抗神经退化疾病的药剂。根据本发明化合物的治疗用途,投药剂量将依所使用的化合物、投药模式、所欲治疗及病症而定。式(I)化合物的每日剂量范围为自1mg/kg至40mg/kg。本发明提供在一个体中抑制HDAC、治疗肿瘤或细胞增殖疾病及增加神经突触生长的方法,包括分别投药治疗上有效量的本发明化合物至该个体。本发明式(I)化合物的一般合成本发明化合物可通过常规方法制备。合成这些化合物的适合方法于实例中提供。一般而言,式(I)化合物可根据图15-22之一合成。式(I)化合物中R₁、R₂、R₃及R₄的甲基化可藉由下列程序达成:将反应物、K₂CO₃及丙酮与Me₂SO₄(DMS)混合,并加热及搅拌该溶液;在控制的气体(例如,N₂)中回流所得溶液一段期间;去除有机溶剂后,将残余物溶解于特定有机溶液并以水清洗;在减压下通过蒸发来干燥有机层并通过硅胶管柱(EtOAc∶n-己烷=1∶4)纯化产物。可藉由下列程序将OH加成至R₅及R₆的双键中:将反应物于THF的溶液添加至冰浴中的H₂SO₄;添加后,搅拌该溶液一段期间并接着以水稀释;以适合的有机溶液(例如CH₂Cl₂)萃取该混合物;在减压下通过蒸发将合并的有机层干燥以得到残余物,并藉由硅胶管柱纯化产物。化合物6a-e及7a-e的制备示于图15及16。蜂胶素G(propolinG)是本领域已知的蜂胶衍生物,其在对应的反应条件下被甲基化、乙酰化、rigio-选择性甲基化(rigio-selectivelymethylated)、及苄基化,以产生化合物2至5,并接着对化合物1-5进行酸性水合,以分别提供标的二氢黄酮6a-e。亚碘酰苯二乙酸盐(iodosobenzenexa0diacetate)氧化接着对化合物1-5进行酸性水合,得到对应的黄酮7a-e。化合物10a-e及12a-e的制备如图17所示。硼氢化钠(sodiumborohydride)还原接着对化合物1-5进行脱水得到对应的化合物9a-e。对9a-e进行酸性水合以分别产生标的化合物10a-e。对化合物9a-e进行MCPBA环氧化(epoxidation)以提供环氧化物11a-e,及接着以对应胺(如甲基胺,乙基胺及enzylamine)分别进行亲核性反应得到标的化合物12a-e。化合物14-17的合成如图18所示。化合物10b的Mitsunobu反应得到所欲的叠氮化物(azide)13,及接着钠反应转变叠氮化物为三级胺14。将化合物10b以三溴化磷进行溴化反应、以酚硫醇(phenolxa0thiol)进行硫化反应、及以亚硫酰氯(thionylchloride)进行氯化反应分别提供溴化物15、硫醇醚17及氯化物16。如图19所述制备化合物18a-d及19a-d。以对应的酰基氯(如乙酰基、丙酰基、苄酰基及异丁酰基)乙酰化化合物10b而分别得到化合物18a-d。以对应的烷基碘(如甲基碘、乙基碘、苄基碘及异丙基碘)烷基化化合物10b而分别得到化合物19a-d。如图20所示合成化合物22。化合物6b的三级醇与溴乙酸乙酯在氢化钠存在下反应得到化合物20。化合物20的碱性水解形成化合物21并接着与羟基胺反应产生羟胺酸22。如图21所述制备羟胺酸28a-e。化合物1与原甲酸三甲酯在酸性条件下反应得到缩丙酮23(acetonidexa023)并接着与烷基碘(如甲基、异丙基及苄基)烷基化,或与苄酰基氯及醋酸酐酰基化分别形成化合物24a-e。化合物24a-e的两个终端烯烃的酸性水合得到化合物25a-e,并接下来与溴乙酸乙酯反应得到化合物26a-e。化合物26a-e的碱性水解形成化合物27a-e,并接下来与羟基胺反应分别产生羟胺酸28a-e。本发明的医药组合物式(I)化合物及其医药可接受盐、立体异构物、对映异构物、前药及溶剂合物可以其本身使用;但一般以医药组合物形式投药,其中式(I)化合物/盐/溶剂合物(活性成份)与医药可接受赋形剂、稀释剂或载剂结合。视投药模式而定,医药组合物较佳包含10至30重量%,更佳为30至50重量%,另更佳为50至70重量%,及甚至更佳为70至100重量%的活性成份;所有重量百分比是基于总组合物。此外,本发明医药组合物可另包含其它预防或治疗与HDAC相关的疾病。本发明医药组合物可被全身投药(administeredsystemically),如以锭剂、胶囊、糖浆、粉末或颗粒形式藉由口服投药;或以溶液或悬浮液形式藉由非经肠口服投药;或藉由皮下投药;或以栓剂形式藉由直肠投药;或透皮给药。本发明化合物及医药组合物为HDAC抑制剂,且可在细胞长时间保留并连续地诱导组织蛋白H4的乙酰化。它们是诱导细胞及神经干细胞分化的HDAC抑制剂。此外,本发明化合物显著抑制HDAC活性。本发明化合物以剂量依赖性方式显著降低细胞的S及G2/M相并改变癌细胞的形态。因此,本发明化合物可治疗肿瘤或细胞增生性疾病。此外,本发明化合物可增加神经突触生长并治疗神经退化疾病及人类SMA。
附图说明
图1显示经不同浓度的NBM-HD-1处理的鼠神经胶质瘤C6细胞的显微镜照片。图2显示藉由FACScan细胞仪分析的鼠神经胶质瘤C6细胞的DNA含量。图3显示经不同剂量的NBM-HD-1处理的鼠神经胶质瘤C6细胞的细胞周期的基因电泳图。图4显示经NBM-HD-1处理的鼠神经胶质瘤C6细胞的免疫萤光染色照片集RT-PCR数据。图5显示经NBM-HD-1及丁酸钠处理的鼠神经胶质瘤C6细胞的西方墨点分析图。图6显示经NBM-HD-1及丁酸钠处理的鼠神经胶质瘤C6细胞的HDAC相对抑制活性。图7显示经不同剂量的NBM-HD-1处理的人类胶质母细胞DBTRG-05MG癌细胞的显微镜照片。图8显示经不同剂量的NBM-HD-1处理的人类乳癌MCF-7细胞的显微镜照片。图9显示NBM-HD-1经由调节细胞周期、以剂量依赖性方式抑制G0/G1相,明显地抑制MCF-7细胞生长。图10显示NBM-HD-1以剂量依赖性方式显著增加p21^WAF1/CIP1基因表达。图11显示经NBM-HD-1处理的MCF-7细胞的西方墨点分析图。图12显示经NBM-HD-1处理的皮质神经元的突触生长的照片。图13显示经不同浓度的NBM-HD-2处理的人类乳癌MCF-7细胞处理的显微镜照片。图14显示以不同浓度的NBM-HD-3处理的人类乳癌MCF-7细胞处理的显微镜照片。图15显示化合物2-4的制备图解。图16显示化合物6a-e及7a-e的制备图解。图17显示化合物10a-e及12a-e的制备图解。图18显示化合物14-17的合成图解。图19显示化合物18a-d及19a-d制备图解。图20显示化合物22的合成图解。图21显示羟胺酸28a-e的制备图解。图22显示化合物2-3及5-7的合成图解。
具体实施方式
下列实施例说明合成及使用本发明化合物的较佳方法:实例1:3′,4′,5′,7′-四甲基-蜂胶素G(2)的制备向蜂胶素G(1.5g,10.16mmol)、K₂CO₃(16.27g,117.89mmol)及丙酮(280mL)的混合物中添加Me₂SO₄(15.76mL,126mmol),并将获得的溶液在氮气下加热回流24小时。去除有机溶剂后,将残余物溶解于CH₂Cl₂(80mL)并以水(40mL×3)清洗。以Na₂SO₄干燥CH₂Cl₂层并在减压下蒸发。所得残余物以硅胶管柱(EtOAc∶正己烷=1∶6)纯化得到化合物2(4.00g,70%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)7.26(1H,d,J=8.6Hz),6.86(1H,d,J=8.6Hz),6.27(1H,s),5.50(1H,dd,J=2.5,13.5Hz),5.14-5.11(1H,m),5.11-5.10(1H,m),5.02-4.99(1H,m),3.87(3H,s),3.83(3H,s),3.79(6H,s),3.50(1H,dd,J=6.6,15.2Hz),3.43(1H,dd,J=5.8,15.2Hz),3.00(1H,dd,J=13.5,16.7Hz),2.68(1H,dd,J=2.6,16.7Hz),2.00-1.92(2H,m),1.75(3H,s),1.70(3H,s),1.65(3H,s),1.60(3H,s),1.52(3H,s);¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)189.4(s),164.0(s),163.3(s),159.6(s),153.0(s),147.2(s),135.6(s),134.2(s),131.5(s),131.3(s),129.8(s),124.1(d),122.8(d),122.7(d),122.1(d),118.2(s),110.3(d),108.7(s),95.6(d),75.9(d),61.8(q),60.7(q),55.7(q),55.7(q),45.1(t),39.6(t),26.6(t),25.7(q),25.6(q),24.9(t),22.0(t),17.7(q),17.6(q),16.3(q);HREIMS计算C₃₄H₄₄O₆(M):548.3142,实测:548.3140。实例2:6-(2-羟基-2-甲基丁基)-2-(7-羟基-3,7-二甲基辛-2-烯基)-3′,4′,5,7-四甲氧基黄酮(6b)的制备在冰浴中向化合物2(7g,12.77mmol)于THF(170mL)的溶液中加入49%H₂SO₄(140mL)。完全添加后,在室温下搅拌反应混合物8小时,并接着以H₂O稀释。以CH₂Cl₂(100mL×3)萃取反应混合物。合并的有机层经Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发而得到残余物,该残余物以硅胶管柱(正己烷∶EtOAc=1∶1~1∶3)纯化而得到纯油6b(2.30g,34%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)7.27(1H,d,J=8.6Hz),6.87(1H,d,J=8.6Hz),6.28(1H,d,J=2.6Hz),5.49(1H,dd,J=2.4,13.6Hz),5.05(1H,t,J=6.0Hz),3.87(3H,s),3.84(3H,s),3.79(6H,s),3.52(1H,dd,J=5.5,15.2Hz),3.43(1H,dd,J=7.6,15.2Hz),2.97(1H,dd,J=8.0,16.7Hz),2.70-2.59(3H,m),1.9392H,t,J=6.4Hz),1.65(3H,s),1.64-1.60(2H,m),1.41-1.32(4H,m),1.25(6H,s),1.15(3H,s),1.14(3H,s);¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)189.4(s),164.0(s),163.3(s),159.6(s),153.0(s),147.2(s),135.6(s),134.2(s),131.5(s),131.3(s),129.8(s),124.1(d),122.8(d),122.7(d),122.1(d),118.2(s),110.3(d),108.7(s),95.6(d),75.9(d),61.8(q),60.7(q),55.7(q),55.7(q),45.1(t),39.6(t),26.6(t),25.7(q),25.6(q),24.9(t),22.0(t),17.7(q),17.6(q),16.3(q);HREIMS计算C₃₄H₄₈O₈(M)584.3338,实测:584.3344。实例3:6-香叶基-3′,4′,5,7-四甲氧基黄酮(30)[(6-Geranyl-3′,4′,5,7-tetramethoxyflavanone)(30)]的制备向化合物29(蜂胶素C,128mg,0.31mmol)、K₂CO₃(431mg,3.1mmol)及丙酮(15mL)的混合物中加入Me₂SO₄(0.25mL,2.48mmol),并将所得溶液在氮气下加热回流24小时。去除有机溶剂后,将残余物溶解于CH₂Cl₂(50mL)并以H₂O(50mL×3)清洗。有机层以Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发。所得残余物以硅胶管柱(EtOAc∶正己烷=1∶4)纯化而得到化合物33(107mg,72%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)6.99-6.97(2H,m),6.88(1H,d,J=8.8Hz),6.31(1H,s),5.33(1H,dd,J=2.8,13.3Hz),5.11(1H,td,J=1,6.9Hz),5.04(1H,td,J=1.3,5.5Hz),3.90(3H,s,OMe),3.88(3H,s,OMe),3.81(3H,s,OMe),3.80(3H,s,OMe),3.34(1H,dd,J=7.2,14.1Hz),3.26(1H,dd,J=7.2,14.1Hz),3.02(1H,dd,J=13.3,16.7Hz),2.74(1H,dd,J=2.8,16.7Hz),2.04-2.00(2H,m),1.96-1.92(2H,m),1.74(3H,s),1.62(3H,s),1.55(3H,s);¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃).189.1(s),164.1(s),163.0(s),159.4(s),149.5(s),149.4(s),131.3,131.2(s),124.4(d),122.9(d),118.9(d),109.5(d),108.9(s),95.7(d),79.2(q),61.9(q),56.1(q),56.0(q),55.9(q),45.6(t),39.8(t),26.7(t),25.7(s),22.0(t),17.7(q),16.1(q);HREIMS计算C₂₉H₃₆O₆(M)为480.2510,实测:480.2511。实例4:6-(2,6-二羟基-2,6-二甲基-辛基)-3′,4′,5,7-四甲氧基黄酮(31)的制备在冰浴中向化合物30(80mxa0g,0.17mmol)于THF(6mL)的溶液中加入49%H₂SO₄(4mL)。完全添加后,在室温下搅拌反应混合物8小时,并接着以H₂O稀释。以CH₂Cl₂(50mL×3)萃取反应混合物。合并的有机层经Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发而得到残余物,该残余物以硅胶管柱(0-3%MeOH/CH₂Cl₂)纯化而得到纯油31(44mg,50%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)6.99-6.97(2H,m),6.88(1H,d,J=8.8Hz),6.31(1H,s),5.33(1H,dd,J=2.8,13.3Hz),3.90(3H,s,OMe),3.88(3H,s,OMe),3.84(3H,s,OMe),3.82(3H,s,OMe),3.02(1H,dd,J=13.3,16Hz),2.75(1H,dd,J=2.8,16Hz),2.62-2.58(2H,m),1.63-1.59(7H,m),1.49-1.48(2H,m),1.23(3H,s),1.22(3H,s),1.21(3H,s);¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)189.1(s),164.1(s),163.0(s),159.4(s),149.5(s),149.4(s),131.2(s),119.0(d),118.9(d),111.3(d),109.5(d),108.9(s),95.8(d),72.9(s),71.1(s),62.1(q),56.0(q),55.9(q),45.5(t),44.5(t),42.3(t),42.1(t),41.5(t),29.4(q),29.3(q),26.9(q),26.8(q),18.8(t),17.5(t);HREIMSxa0xa0计算(M-18)498.2602,实测:498.2610。实例5:蜂胶素A(33)的制备在冰浴中向蜂胶素D(化合物32,100mg,0.24mmol)于THF(6mL)的溶液中加入49%H₂SO₄(4mL)。完全添加后,在室温下搅拌反应混合物8小时,并接着以H₂O稀释。以CH₂Cl₂(50mL×3)萃取反应混合物。合并的有机层经Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发而得到残余物,该残余物以硅胶管柱(0-3%MeOH/CH₂Cl₂)纯化而得到纯油33(42mg,40%):¹H-NMR(400MHz,MeOD)6.87(1H,d,J=8.4Hz),6.71(1H,d,J=8.4Hz),5.88(2H,dd,J=1.9,3.3Hz),5.47(1H,dd,J=2.6,13Hz),5.12(1H,dd,J=5.7,6.7Hz),3.47(2H,d,J=6.6Hz),3.10(1H,dd,J=13.4,17Hz),2.60(1H,dd,J=2.7,17.1Hz),1.94(1H,dd,J=6.6,13.4Hz),1.64(1H,d,J=0.5Hz),1.43-1.41(2H,m),1.37-1.34(2H,m),1.13(3H,s),1.12(3H,s);¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃).198.2(s),168.5(s),168.4(s),165.5(s),165.4(s),165.2(s),146.5(s),144.5(s),135.8(s),129.7(s),128.2(s),124.7(d),118.7(d),113.6(d),103.2(s),97.1(d),96.2(d),77.8(d),71.5(s),44.3(t),43.7(t),41.2(t),29.2(q),29.1(q),25.4(t),23.7(t),16.2(t)。实例6:3′,4′,5,7-四乙酰基蜂胶素D(34)的制备将醋酸酐(2mL)加入蜂胶素D(化合物32,124mg,0.29mmol)于吡啶的溶液并在室温下搅拌反应混合物6小时。将EtOAc(25mL)加入反应混合物并以0.1Nxa0HCl(10mL×3)清洗混合物。以Na₂SO₄干燥有机层并在减压下蒸发而得到残余物。该残余物以硅胶管柱(CH₂Cl₂)纯化而得到纯油34(139mg,80%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)7.49(1H,d,J=8.6Hz),7.18(1H,d,J=8.6Hz),6.72(1H,d,J=2.2Hz),6.53(1H,d,J=2.2Hz),5.60(1H,dd,J=2.5,13.8Hz),5.01(1H,td,J=5.3,4.6Hz),4.94(1H,td,J=1.0,5.8Hz),3.35(1H,dd,J=7.1,15.7Hz),3.26(1H,dd,J=5.3,15.5Hz),2.98(1H,dd,J=13.8,16.8Hz),2.36(3H,s),2.27(6H,s),2.26(s,3H),2.02-1.91(5H,m),1.64(3H,s),1.62(3H,s),1.55(3H,s);¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃).188.8(s),169.2(s),168.1(s),168.0(s),167.9(s),163.2(s),155.9(s),151.3(s),142.8(s),140.9(s),137.0(s),135.2(s),133.5(s),131.6(s),124.5(d),123.9(d),121.6(d),120.7(d),111.6(s),110.7(d),109.0(d),76.1(d),44.8(t),39.4(t),26.5(t),25.6(t),25.5(q),21.1(q),21.0(q),20.7(q),20.3(q),17.7(q),16.3(q)。实例7:3′,4′,5,7-四甲基蜂胶素D(35)的制备向化合物32(128mg,0.31mmol)、K₂CO₃(431mg,3.1mmol)及丙酮(15mL)的混合物中加入Me₂SO₄(0.25mL,2.48mmol),并将所得溶液在氮气下加热回流24小时。去除有机溶剂后,将残余物溶解于CH₂Cl₂(50mL)并以H₂O(50mL×3)清洗。有机层以Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发。所得残余物以硅胶管柱(EtOAc∶正己烷=1∶4)纯化而得到化合物35(107mg,72%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)7.26(1H,d,J=8.6Hz),6.85(1H,d,J=8.6Hz),6.10(1H,d,J=2.3Hz),6.07(1H,d,J=2.3Hz),5.34(1H,dd,J=2.6,13.5Hz),5.04(1H,td,J=5.3,4.6Hz),4.99(1H,td,J=1.0,5.8Hz),3.88(3H,s),3.86(3H,s),3.80(3H,s),3.74(3H,s),3.46(1H,dd,J=6.6,15.2Hz),3.44(1H,dd,J=5.8,15.2Hz),3.02(1H,dd,J=13.5,16.5Hz),2.69(1H,dd,J=2.6,16.5Hz),2.00-1.97(2H,m),1.94-1.92(2H,m),1.65(3H,s),1.60(3H,s),1.52(3H,s)。实例8:3′,4′,7-O-三甲基蜂胶素G(4)的制备ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="152"/>向蜂胶素G(2.30g,2.75mmol)、K₂CO₃(1.94g,13.99mmol)及丙酮(80mL)的混合物中加入Me₂SO₄(2.17mL,17.35mmol),并将所得溶液在室温下搅拌0.5小时,并接着在氮气下加热回流6小时。去除有机溶剂后,将残余物溶解于CH₂Cl₂(40mL)并以H₂O(40mL×3)清洗。CH₂Cl₂层以Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发。所得残余物以硅胶管柱(EtOAc∶正己烷=1∶8)纯化而得到化合物4(954mg,65%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)12.06(1H,s),7.26(1H,d,J=8.4Hz),6.86(1H,d,J=8.4Hz),6.03(1H,s),5.50(1H,dd,J=2.4,13.4Hz),5.17-5.14(1H,m),5.04-5.00(2H,m),3.87(3H,s),3.79(3H,s),3.79(6H,s),3.46-3.45(2H,m),3.25-3.23(2H,m),3.05(1H,dd,J=13.5,16.7Hz),2.70(1H,dd,J=2.6,16.7Hz),2.02-1.94(7H,m),1.75(3H,s),1.67(3H,s),1.66(3H,s),1.61(3H,s),1.58(3H,s)。实例9:6-(2-羟基-2-甲基丁基)-2-(7-羟基-3,7-二甲基辛-2-烯基)5-羟基-3′,4′,7-三甲氧基黄酮(6d)的制备ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="134"/>在冰浴中向化合物4(530mg,0.99mmol)于THF(15mL)的溶液中加入49%H₂SO₄(10mL)。完全添加后,在室温下搅拌反应混合物8小时,并接着以H₂O稀释。以CH₂Cl₂(30mL×3)萃取反应混合物。合并的有机层经Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发而得到残余物,该残余物以硅胶管柱(正己烷∶EtOAc=1∶1)纯化而得到纯油6d(191mg,34%):¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)12.06(1H,brs),7.27(1H,d,J=8.6Hz),6.86(1H,d,J=8.6Hz),6.05(1H,s),5.50(1H,dd,J=2.6,13.6Hz),5.03(1H,t,J=6.2Hz),3.87(3H,s),3.80(6H,s),3.48(1H,dd,J=5.5,15.2Hz),3.42(1H,dd,J=6.1,15.2Hz),3.06(1H,dd,J=13.6,17.1Hz),2.70(1H,dd,J=2.7,17.1Hz),2.65-2.61(2H,m),1.95-1.92(2H,m),1.65(3H,s),1.41-1.35(5H,m),1.26(6H,s),1.15(3H,s),1.14(3H,s)。实例10:其它化合物下列二个化合物是根据上述方法制备。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="147"/>实例11:本发明化合物(NBM-HD-1)对癌细胞生长的抑制ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="155"/>(NBM-HD-1)将癌细胞株,鼠C6神经胶质瘤细胞(ratxa0C6xa0gliomaxa0cells),在37°C、5%CO₂及95%相对湿度下,培养于补充有盘尼西林G、硫酸链霉素、0.5mMxa0L-谷酰胺及10%胎牛血清(FBS;Gibco)的Dulbecco’sxa0modifiedxa0Eagle′s培养基(DMEM;Gibco)。在所有实验中,细胞以每孔3×10⁵的密度接种于6孔盘。24小时后,以不同浓度的化合物NBM-HD-1(即,本文中所示的式III化合物)处理细胞。48小时后,观察并计数细胞。根据图1所示的结果,NBM-HD-1可抑制鼠C6神经胶质瘤细胞的生长。以2.5μg/mL(图1(A)-b)、5μg/mL(图1(A)-c)及10μg/mL(图1(A)-d)的NBM-HD-1培养鼠C6神经胶质瘤细胞48小时,相较于控制组(图1(A)-a),细胞密度大幅减少。由细胞计数所得结果显示相同的趋势(图1(B))。上述结果表明,NBM-HD-1以剂量依赖性方式抑制鼠C6神经胶质瘤细胞的生长。以各种浓度(0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL及10μg/mL)的NBM-HD-1处理1×10⁶个鼠C6神经胶质瘤细胞72小时。经处理细胞被胰蛋白酶水解并收集。将细胞再悬浮于200μLxa0PBS中并接着加入800μL的冷100%乙醇以固定细胞。所得细胞在-20°C固定过夜。通过离心收集细胞团块,再悬浮于1mL的低张缓冲液(0.5%Tritonxa0X-100于PBS及1μg/mLxa0RNasexa0A),并于37°C下培养30分钟。接着,将1mL的PI溶液(50μg/mL)添加于所得细胞团块。将混合物置于4°C下30分钟。以FACScanCytometry(Bectonxa0Dickinson)分析细胞的DNA量(图2)。图2的结果显示,NBM-HD-1通过调节抑制G0/G1相的细胞周期,以剂量依赖性方式显著抑制鼠C6神经胶质瘤细胞的生长。实例12:本发明化合物(NBM-HD-1)对细胞生长的抑制及癌细胞分化的诱导针对鼠C6神经胶质瘤细胞,通过RT-PCR检测与mRNA表达有关的细胞周期。根据制造者的指示,使用RNeasyxa0MiniKit(Qiagen)自经处理的C6细胞分离总RNA。使用ReverTra-Plus-TM(TOYOBO)自500ng的总RNA产生cDNA。藉由PCR及引子放大RT产物(1μl),并使用GAPDH作为内部控制以分析细胞周期的数个基因,结果示于图3。根据图3的结果,NBM-HD-1可调节一些细胞周期调节子的表达。结果显示NBM-HD-1是以剂量依赖性方式降低细胞周期素D1及细胞周期素B1的表达。相反地,p21的表达增加。以10μg/mL的NBM-HD-1培养C6神经胶质瘤细胞24小时后,它们被固定并以典型免疫萤光染色法分析。胶质细胞的染色是使用胶质细胞专一性的GFAP抗体(SIGMA)作为初级抗体及萤光标记的兔免疫球蛋白(SIGMA)作为二级抗体与初级抗体结合。用特定光源激发GFAP-正(GFAP-positive)的细胞以发散萤光。以DAPI染色细胞核。染色结果如图4(A)所示。根据图4(A),NBM-HD-1可诱导C6神经胶质瘤细胞的GFAP表达。相对于控制组,以10μg/mL的NBM-HD-1处理的细胞被检测出较多的GFAP蛋白质。图4(A)中间列显示经DAPI染色的细胞的照片。GFAPxa0mRNA的表达是由RT-PCR进行检测。图4(B)的结果显示,GFAP的表达以剂量依赖性方式增加。根据GFAP表达的增加,这些结果表明NBM-HD-1可诱导C6神经胶质瘤细胞的分化。实例13:以本发明化合物(NBM-HD-1)处理的癌细胞中高度乙酰化组织蛋白(hyperacetylatedxa0histone)的蓄积的增加高度乙酰化组织蛋白H4的蓄积是以细胞溶裂物,使用西方墨点分析(westernxa0blotting)及抗乙酰化组织蛋白H4抗体(Upstate)进行分析。C6神经胶质瘤细胞以每10厘米培养皿1×10⁶的密度接种。24小时后,以10μg/mL的NBM-HD-1或4mM丁酸钠处理数小时。使用变性SDS样品缓冲液制备全细胞溶裂物,并接着于15%SDS-聚丙烯酰胺胶上分离。如图5所示,丁酸钠及NBM-HD-1均可增加高度乙酰化组织蛋白H4的蓄积。在未处理的C6神经胶质瘤细胞中难以检测到乙酰化组织蛋白H4的量。经4mM丁酸钠处理2个小时的细胞中的乙酰化组织蛋白H4的量增加。接着自培养基中将丁酸钠去除。6小时后,乙酰化组织蛋白H4的量降低。在以NBM-HD-1处理2小时的细胞中,乙酰化组织蛋白H4的蓄积增加。去除NBM-HD-1后,乙酰化组织蛋白H4的量随时间增加。最高的组织蛋白乙酰化出现于化合物去除后6小时。这些结果表明,类似于丁酸钠,NBM-HD-1是一种HDAC抑制剂。由于NBM-HD-1较丁酸钠更具疏水性,相较于丁酸钠,NBM-HD-1可保留于细胞中较长时间且可连续诱导组织蛋白H4的乙酰化。实例14:以本发明化合物(NBM-HD-1)对HDAC活性的抑制以不同剂量的NBM-HD-1及丁酸钠(SB)处理C6神经胶质瘤细胞。24小时后,收取细胞并依制造者说明书使用NuBuster^TM蛋白质萃取套组(Novagen)萃取核蛋白。接者使用HDAC活性分析套组(Calbiochem)分析所述萃取物的HDAC抑制活性。将包含乙酰化的离胺酸侧链的HDAC萤光基质首先与萃取的核蛋白一起培养。基质的乙酰化使基质敏感化,使得在以赖氨酸扩展剂(lysinexa0developer)处理的第2步骤中产生萤光团。使用萤光分析仪(fluorescentxa0platexa0reader)可容易分析萤光团。如图6所示,NBM-HD-1可抑制C6神经胶质瘤细胞中的HDAC活性。HDAC的抑制意味着诱导癌细胞的分化。在本实验中,用于HDAC抑制的已知化合物丁酸钠被用作正控制组。在实验组中,较低的萤光单位显示较高的HDAC抑制活性。此结果说明NBM-1HD-1显著抑制HDAC活性。实例15:以本发明化合物(NBM-HD-1)对HDAC活性的抑制及癌细胞型态的改变将人类胶质母细胞瘤DBTRG-05MG癌细胞在37°C、5%CO₂及95%相度湿度下,培养于补充了盘尼西林G、硫酸链霉素、0.5mM的L-谷酰胺及10%胎牛血清(FBS;Gibco)、100mM/L丙酮酸钠及1%NEAA(Gibco)的RPMI培养基1640(Gibco)。针对这些实验,将细胞以每孔3×10⁵的密度于6-孔盘。24小时后,以不同浓度的NBM-HD-1及4mM的丁酸钠处理细胞。72小时后,观察并计数细胞。如图7所示,NBM-HD-1显著抑制05MG癌细胞的生长并改变细胞的形态。在05MG细胞(图7(A))中,经过以2.5μg/mL(图7(A)-b)、5μg/mL(图7(A)-c)及10μg/mL(图7(A)-d)的NBM-HD-1培养72小时,相较于控制组(图7(A)-a),细胞密度大幅减少。实验组中的05MG细胞变得比控制组细胞更长。细胞计数的结果(图7(B))指出丁酸钠可抑制05MG癌细胞的增殖,且NBM-HD-1亦可抑制05MG癌细胞的增殖。这些结果说明,NBM-HD-1以剂量依赖性方式抑制05MG细胞的生长并改变05MG癌细胞的形态。将乳癌细胞在37°C、5%CO₂及95%相度湿度下,培养于补充了盘尼西林G、硫酸链霉素、0.5mM的L-谷酰胺及10%胎牛血清(FBS;Gibco)的Dulbecco′sxa0modifiedxa0xa0Eagles′s培养基(DMEM;Gibco)。将细胞以每孔3×10⁵的密度接种于6-孔盘。24小时后,以不同浓度的化合物NBM-HD-1及作为正控制组的4mM的丁酸钠处理细胞。48小时后观察细胞并于96小时后计数。如图8所示,NBM-HD-1显著抑制MCF-7癌细胞的生长并改变细胞的型态。在图8(A),以2.5μg/mxa0L(图8(A)-b)、5μg/mL(图8(A)-c)及10μg/mL(图8(A)-d)的NBM-HD-1培养48小时,相较于控制组(图8(A)-a),MCF-7细胞的密度大幅减少。相较于控制组细胞,实验组中的MCF-7细胞的型态改变。图8(B)显示4mM丁酸钠可抑制MCF-7细胞的生长。细胞计数的结果(图8(B))表明,类似于丁酸钠,NBM-HD-1抑制细胞生长。这些结果表明,NBM-HD-1以剂量依赖性方式抑制MCF-7癌细胞的生长并改变它们形态。将100毫米培养皿中的MCF-7癌细胞(1×10⁶)以各种浓度的NBM-HD-1(0、2.5、5及10μg/mL)和4mM丁酸钠处理72小时。样品的制备如实例8中所述的步骤所述。细胞的DNA接着由FACScan细胞仪(FACScanxa0cytometry)(Bectonxa0Dickinson)分析。如图9所示,NBM-HD-1通过调节细胞周期、以剂量依赖性方式抑制G0/G1相,明显地抑制MCF-7细胞生长。G0/G1相的百分比以剂量依赖性方式自74.46增加至92.55。亦发现NBM-HD-1以剂量依赖性方式显著减少S及G2/M两相的细胞。与细胞周期有关的p21mRNA表达是藉由RT-PCR检测。总RNA是自经处理的MCF-7细胞中分离并用于RT反应。cDNA(1μl)被用作模板以藉由PCR放大p21基因。GAPDH被用作内部控制。如图10所示,NBM-HD-1可增加p21mRNA在MCF-7癌细胞中的表达。在该实验中,MCF-7细胞以不同剂量的NBM-HD-1处理24小时。该结果表明,NBM-HD-1以剂量依赖性方式诱导p21的表达。使用西方墨点分析及结合乙酰化组织蛋白H4的抗体(Upstate)分析细胞溶裂物的高乙酰化组织蛋白H4的蓄积。以每10厘米培养皿1×10⁶的密度接种MCF-7癌细胞。24小时后,以10μg/mL的NBM-HD-1或4mM丁酸钠处理细胞数小时。以针对高度乙酰化组织蛋白H4的特定抗体分析组织蛋白乙酰化的程度以试验NBM-HD-1对HDAC的抑制。丁酸钠被用作正控制组。如图11所示,MCF-7细胞的结果与C6神经胶质瘤细胞的结果类似。实例16本发明化合物(NBM-HD-1)增加神经突触的生长神经干细胞(NSC)及皮质神经元的生长培养基的制备是添加盘尼西林G、链霉素及0.5mM的L-谷酰胺至B-27补充的神经基质培养基(Gibco)。未出生的胎是取自怀孕17天的麻醉中Wistar大鼠腹腔中的胎囊。将胎的脑组织取出并以0.1%胰蛋白酶溶液在25°C下处理3分钟。以PBS溶液清洗3次后,细胞藉由上下混合而分离。所得溶液通过70μm尼龙(nylon)细胞过滤器(strainer)(Falcon)以得到含有脑细胞的过滤物。过滤物在1000rpm离心10分钟并吸去上清液。所得团块再悬浮于如上述所制备的生长培养基。所得悬浮液含有NSC。得自悬浮液的细胞培养于涂覆有30μg/mL的聚-D-赖氨酸(Sigma)的6-孔盘至75细胞/平方毫米的密度。细胞培养于37°C、5%CO₂及95%的相对湿度。生长培养基含有0.63μg/mL的NBM-HD-1,并使用含1μLxa0DMSO的生长培养基作为控制组。培养后的分化细胞被分类称为皮质神经元。培养6天后,藉由显微镜观察活细胞。对神经元的突触在6个区域的长度进行测定并平均。如图12所示,NBM-HD-1可促进神经突触生长。在图12中,实验组的突触长度(图12(A)-b)较控制组长(图12(A)-a)。测定突触长度后,结果表明,实验组突触的平均长度大于控制组(图12(B))。实例17:本发明化合物(NBM-HD-2)对癌细胞生长的抑制将MCF-7癌细胞以每孔3×10⁵的密度接种于6-孔盘。24小时后,以不同浓度的化合物NBM-HD-2及作为正控制组的4mM的丁酸钠处理细胞。72小时后,观察并计数细胞。如图13所示,NBM-HD-2显著抑制MCF-7癌细胞的生长并改变细胞的形态。在图13(A),经过以2.5μg/mL(图13(A)-c)、5μg/mL(图13(A)-d)、7.5μg/mL(图13(A)-e)及10μg/mL(图7(A)-f)的NBM-HD-2培养72小时,相较于控制组(图13(A)-a),MCF-7细胞密度大幅减少。相较于控制组,实验组中的MCF-7细胞的形态改变。图13(A)显示4mM丁酸钠可抑制MCF-7细胞的生长。细胞计数的结果(图13(B))指出,类似于丁酸钠,NBM-HD-2抑制细胞生长。这些结果表明,NBM-HD-2以剂量依赖性方式抑制MCF-7癌细胞的生长并改变它们的形态。实例18:本发明化合物(NBM-HD-3)对癌细胞生长的抑制将MCF-7癌细胞以每孔3×10⁵的密度接种于6-孔盘。24小时后,以不同浓度的化合物NBM-HD-3及4mM的丁酸钠(其作为正控制组)处理细胞。72小时后,观察并计数细胞。如图14所示,NBM-HD-3显著抑制MCF-7癌细胞的生长并改变细胞的形态。在图14(A),经过以2.5μg/mL(图14(A)-c)、5μg/mL(图14(A)-d)、7.5μg/mL(图14(A)-e)及10μg/mL(图14(A)-f)的NBM-HD-3培养72小时,相较于控制组(图14(A)-a),MCF-7细胞密度大幅减少。相较于控制组,实验组中的MCF-7细胞的形态改变。图14(A)显示4mM丁酸钠可抑制MCF-7细胞的生长。细胞计数的结果(图14(B))表明,类似于丁酸钠,NBM-HD-3抑制细胞生长。这些结果表明,NBM-HD-3以剂量依赖性方式抑制MCF-7癌细胞的生长并改变它们的形态。